基于腺病毒基因疗法的案例研究

Y. Dohogne1 , F. Collignon1 , J.-C. Drugmand 1 , M. Gras1 , M.Jourdan1 , J. Castillo 1 , S. Kumano 2 , H. Shiomi 2

 摘要

⽤于⽣产病毒载体的贴壁细胞被⼴泛应⽤于基因疗法的开发和商业化。传统的⼯业流程使⽤静态培养⽅法（例如细胞工厂），但这些⽅法受到许多限制：它们缺乏精确的环境控制（pH、DO、培养基成分），严重依赖⼿动操作，并且只能横向扩展而不是纵向扩⼤规模。对改进的、⾃动化的和可扩展⽣产的⼯具需求是双重的：基因疗法通常需要每个患者使⽤⼤剂量的活性病毒制剂，不久的将来全球对后者的需求预计将显著上升。Univercells 开发了⼀种可扩展的固定床⽣物反应器，它提供了客户可负担的满足市场所需数量的机会。在这项研究中，一个使用 HEK293 细胞⽣产腺病毒的工艺过程被从细胞工厂转移到固定床⽣物反应器。此外，⼀项在固定床生物反应器内从现有含血清培养转化为无血清培养的可⾏性研究被实施。

1.scale-X^TM一次性固定床生物反应器

scale-X hydro⽣物反应器系统由⼀次性固定床⽣物反应器组成，它为细胞粘附提供了螺旋缠绕，非编织聚对苯⼆甲酸⼄⼆醇酯（PET）织物层的2.4m2表⾯积。该系统提供pH、DO 和温度控制的自动控制、培养基和细胞采样以及通过再循环回路允许进一步添加培养基的泵（图 1）。

图1. scale-X carbo生物反应器示意图

（a）生物反应器和再循环回路  （b）固定床结构  （c）固定床内的液体流动模式

位于⽣物反应器内部的磁性离⼼叶轮提供两种功能：良好的混合确保整个固定床中营养物质的均匀可⽤，以及通过容器顶部空间形成“瀑布流”进⾏通⽓。后者增加了可⽤于⽓体交换的表⾯积，从⽽确保系统中有⾜够的体积传质系数 (kLa)。

scale-X hydro是⽣物反应器组合的⼀部分，可进⾏⼯艺开发和中试规模培养（scale-X carbo，10 - 30 m²）、中等规模到⼤规模⼯业⽣产（scale-X nitro，200 - 600 m²，通常适⽤于疫苗⽣产）和更⼤规模的⼯业⽣产（scale-X oxo，>2000 m²，以满⾜基因治疗的需求）（图2）。

图2.  scale-X固定床生物反应器系列

2.  材料和方法.

设备

scale-X

»  scale-X hydro 生物反应器（2.4m²生长表面积）

»  预培养：来⾃冷冻细胞库的 HEK293 细胞，接种在细胞培养瓶中并在 37°C、10% CO₂ 下孵育

»  收获的细胞形成⽣物反应器实验的接种种子。Bioreactor#1-4接种在含血清培养基中，密度为3.10⁴cells/cm², Bioreactor#5接种在无血清培养基中，密度为4.10⁴cells/cm²

对照

»  Corning CellBIND CS2 细胞培养室作为#1-4的对照；Corning T225 通⽓盖细胞培养瓶作为#5的对照

»  在加湿培养箱中使⽤相同的接种密度和体积比例的培养基进⾏操作

»  通过胰蛋白酶重复消化确定细胞的密度

分析

»  通过结晶紫染⾊对载体进⾏细胞核计数来测量细胞密度

»  使⽤ Adeno-X 快速滴度试剂盒 (Clontech) 测量病毒滴度

培养条件总结

实验设置和培养参数

图3描述了在scale-X hydro生物反应器中细胞培养和感染的过程。第一次实验，过程被终止在第三步（细胞扩增）。其余实验完成了病毒感染。

图3. 实验装置的工艺流程图

3.     从细胞工厂到生物反应器的迁移

采用scale-X生物反应器体系培养HEK293细胞。先前的工作演示了在固定床上横向和纵向的细胞分布（图4）。

这个趋势显示了整个固定床两个方向细胞的分布，这对于减少不同性质的小范围的细胞群的形成并确保良好的生产力是重要的。

图4. Scale-X hydro中横向和纵向细胞分布

4.     细胞生长和病毒表达

概念目标的验证

这个研究展现的是旨在从一个不可扩展的细胞工厂到可扩展的scale-X hydro生物反应器系统的概念实验的验证。据此，设定了三个目标：

1.      细胞培养迁移至生物反应器并扩增

2.      ⽣物反应器中腺病毒感染细胞及产物回收

3.      无血清培养（SFM）的额外可行性研究：细胞培养和病毒生产

细胞生长

图 5 显⽰了五个独⽴实验中测量的细胞密度。在相同条件下，将培养物从多层细胞培养瓶迁移⾄⽣物反应器，在第 3 天（平均 134%，n=3）和第 6 天（197%，n=1）均生产出了更⾼的细胞密度。第⼆和第三个培养物分别在接种后第2天和第3天被感染（感染后的细胞密度未显示）。

图5.  在scale-X hydro生物反应器和细胞工厂中HEK293细胞生长曲线的对比

在scale-X（128%，n=1）生物反应器上观察到了更高的细胞密度，并已通过无血清培养再现。为了获得⽣物反应器 #1 所⻅的⾮常⾼的细胞密度，在第 3 天更换对照和⽣物反应器中 85% 的培养基。在⽆⾎清培养基过渡过程中观察到的预期⽣⻓速率下降并没有阻⽌细胞粘附到固定床上，并在 3 天后达到⽬标细胞密度。

病毒表达

图6显⽰了⽣物反应器#2⾄#5中获得的病毒产量。对于含⾎清的⼯艺流程，⽣物反应器中的病毒滴度⽐对照低约 0.53 log(IFU)，这对于没有经过⼯艺开发⼯作而直接迁移培养条件来说是⼀个有希望的结果。在无血清培养中也获得了类似的有希望的滴度。

图6. 从scale-X hydro生物反应器到静态培养对照

生物反应器#2-4 含血清培养基，生物反应器#5 无血清培养基

后续⼯作将聚焦于 (a) 确定关键⼯艺参数 (CPC)，然后 (b) 在⽣物反应器中对其进⾏优化。这对于传统的静态培养过程来说是一个壮举，因为传统的静态培养方式缺乏对诸如pH 值和溶氧（DO）等过程参数的控制。

基于在⽣物反应器中的单个实验，细胞⽣⻓和得率数据均表明，在scale-X hydro生物反应器中，对比含血清的腺病毒生产，⽆⾎清培养流程看起来是一个良好的替代方案。

结论和下一步计划

对于scale-X 系统，我们已经阐明了达到独特的高细胞密度和好的腺病毒产量的能力。下述目标已经实现：

Ø   已成功实现细胞培养从静态的细胞工厂到固定床生物反应器的转移

Ø   在受控环境条件（pH、溶氧（DO） 和温度）下进⾏⾼密度培养

Ø   有希望的病毒产量以及关键工艺参数的确定和优化的范围

Ø   与含血清培养基的静态培养相比，无血清培养基获得了类似的细胞密度和高病毒产量，阐明了使用无血清工艺的scale-X生物反应器以经济有效的方式生产腺病毒的可能性

»  不同于其他贴壁细胞培养技术，scale-X 可以轻松地从实验室扩大到工厂。 当缩短上市时间是关键时，这种平稳过渡降低了工艺开发阶段的风险

»  其他结果（此处未显示）证明了整个过程（整个无血清培养过程或接种感染后的转换）中培养基更换时间的可能灵活性，而不会损失滴度

»  下一步将涉及工艺开发以进一步提高病毒滴度以及工艺放大的研究